? 服務(wù)介紹

       蛋白質(zhì)免疫印跡法 (Western Blot ) ，簡(jiǎn)稱(chēng)WB ，是指通過(guò)SDS-PAGE膠將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開(kāi)，然后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到載體(PVDF)膜上，利用抗原抗體的特異性結(jié)合，用特異性的一抗結(jié)合目標(biāo)蛋白，用HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗，再加以ECL發(fā)光液顯色，檢測(cè)組織或者細(xì)胞內(nèi)某種或者某些特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)。蛋白質(zhì)免疫印跡是做蛋白質(zhì)分析的一種常規(guī)技術(shù)，常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析，還可以用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。

? 實(shí)驗(yàn)流程

       蛋白提取-制膠-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-化學(xué)發(fā)光-結(jié)果分析;

? 實(shí)驗(yàn)樣品要求

       （1）細(xì)胞不少于5×106個(gè)，收集細(xì)胞沉淀，干冰運(yùn)輸。

       （2）組織樣品不少于50mg；

       （3）總蛋白濃度不低于 2μg/μl（至少50μl）；

? 注意事項(xiàng)

       （1）每張膜上做一種目的蛋白和相應(yīng)的內(nèi)參蛋白。每張膜上可以做8個(gè)樣品。一般狀況下，2周即可完成實(shí)驗(yàn)。如遇特殊情況，如一抗不好，蛋白濃度低或蛋白特殊，如分子量大等，周期會(huì)有所延長(zhǎng)。

       （2）Western Blot細(xì)胞蛋白樣本的準(zhǔn)備及運(yùn)輸：去掉培養(yǎng)液，用PBS洗一次后，加入少量PBS，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，用1ml槍吸取細(xì)胞易于1.5ml EP管中，快速離心（升至最高轉(zhuǎn)速就可stop）去除上清后，可按下面兩種方法運(yùn)輸：A.細(xì)胞干運(yùn)輸：將細(xì)胞干放入液氮速凍，-80℃保存; 如需長(zhǎng)途過(guò)夜運(yùn)輸，建議干冰運(yùn)輸；如當(dāng)天送達(dá)樣本，可用液氮或者-80℃冰袋運(yùn)輸；B.細(xì)胞裂解液運(yùn)輸：加入一定量的胞裂解液后即可冷藏運(yùn)輸（冰袋或者冰盒）。如需檢測(cè)磷酸化蛋白，建議裂解液中加入終濃度1mM的NaF，NaF可抑制磷酸酶活性，保護(hù)蛋白磷酸化水平。如果加入裂解液后提取蛋白，則置于冰上裂解1 h，12000rpm離心10 min后取上清，即為蛋白樣本。蛋白樣本可-20度冷藏運(yùn)輸（建議快遞寄送用干冰或者足量-80度冰袋），保存需要-80℃。

       （3）蛋白樣本運(yùn)輸：蛋白樣本需要經(jīng)過(guò)濃度測(cè)定，再進(jìn)行變性，變性時(shí)先加入Sample buffer，再95℃ 10 min，Sample buffer可防止變性導(dǎo)致的蛋白沉淀析出。變性的蛋白可直接冷藏運(yùn)輸，-20℃穩(wěn)定保存。