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miRNA研究思路

      一．技術(shù)路線
 

       二．研究內(nèi)容

第一步 確定差異miRNA表達

        利用 RT-PCR 或者 RT-qPCR 檢測 miRNA 在不同細胞或者組織中的表達水平。

第二步miRNA的功能研究

       探討miRNA功能可用 gain/loss of function 策略，過表達或沉默 lncRNA 后觀察表型。即研究 lncRNA 功能獲得后或者功能缺失后對細胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移與克隆形成，以及病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制等的影響。

      （1）功能獲得性研究

構(gòu)建 miRNA 過表達質(zhì)粒或者慢病毒、腺病毒包裝載體。原則上是將全長miRNA 定向克隆到表達載體上實現(xiàn)miRNA 的過表達。

      （2）功能缺失性研究

可用 siRNA、shRNA、反義核酸、CRISPR/Cas9 等方法沉默 lncRNA，經(jīng) qRT-PCR 或 FISH 等驗證后觀察其對疾病相關(guān)基因表達和對細胞表型等的影響。

第三步 miRNA靶基因的預(yù)測

       通過miRBase， targetscan，starbase等在線網(wǎng)站預(yù)測可以與miRNA結(jié)合的靶基因，并通過間接實驗和直接實驗進行驗證。

      （1）間接實驗：通過WB或qPCR的方法檢測miRNA過表達或抑制細胞株中靶基因的表達水平

      （2）直接實驗：

       a. 雙熒光素酶實驗：

       b. EMSA

       c. CHIP

第四步 挽救實驗

       假如miRNA對靶基因的調(diào)控是經(jīng)典的負調(diào)控關(guān)系，miRNA過表達后會對細胞的某些功能表型產(chǎn)生影響，那么挽救實驗就是將靶基因再過表達后看下這些功能表型能否逆轉(zhuǎn)。

第五步 機制研究

       miRNA的作用機制類型很多，除經(jīng)典的靶向負調(diào)控靶基因外，還有以下7種類型，需根據(jù)不同的機制選擇不同的研究方法進行研究。

     （1）miRNA的前體pri-miRNA可翻譯為多肽

     （2）miRNA可與其他功能蛋白相結(jié)合

     （3）miRNA可直接激活TLR受體蛋白（非改變表達量）

     （4）miRNA可提高蛋白表達水平

     （5）miRNA靶向調(diào)控線粒體相關(guān)基因mRNA

     （6）miRNA可直接激活基因轉(zhuǎn)錄過程

     （7）miRNA可靶向負調(diào)控其他非編碼RNA的前體RNA

第六步 體內(nèi)驗證

      有條件的實驗室可以繼續(xù)通過動物實驗，在體內(nèi)或者臨床樣本水平進行驗證。

參考文獻：

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      [4] Shi DM. miR-296-5p suppresses EMT of hepatocellular carcinoma via attenuating NRG1/ERBB2/ERBB3 signaling. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2018;

      [5] Wang Y. Dysregulation of miR-6868-5p/FOXM1 circuit contributes to colorectal cancer angiogenesis. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2018. 

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