Exosomes作為活細(xì)胞分泌的含有RNA和蛋白質(zhì)的微囊，大小為30-100nm，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多種體液中。最新研究表明，體液中exosomal RNA（特別是miRNA、lncRNA和circRNA）在不同的疾病模型中存在明顯的表達(dá)差異。同時(shí)，這些分子被exosomes的脂膜所包裹和保護(hù)，能保持其原有穩(wěn)定性和 生物學(xué)功能，有望成為液體活檢的重要分子標(biāo)志物。
       環(huán)狀RNA（circular RNA）是最近發(fā)現(xiàn)的一類特殊的非編碼RNA，它大量存在于真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，是mRNA在剪接的過程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀RNA分子。
       近年研究發(fā)現(xiàn)，高等動(dòng)物中環(huán)狀RNA的種類和含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過預(yù)期。circRNA具有很多重要的調(diào)控功能，例如，circRNA可以作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）結(jié)合胞內(nèi)miRNA，阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用。除此以外，circRNA也具有調(diào)控其他類型RNA、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性等功能。circRNA在不同物種中具有保守性和組織表達(dá)特異性，且circRNA對RNase不敏感，因此它比線性RNA更為穩(wěn)定，所以circRNA在疾病新型診斷與治療方法研發(fā)方面有巨大潛力和重要意義。

1、實(shí)驗(yàn)方案
     測序平臺(tái)和方式：Illumina 平臺(tái)   PE150
     數(shù)據(jù)量：12G clean data/樣

2、數(shù)據(jù)分析
（1）測序質(zhì)量評(píng)估：
              原始數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)
              Clean數(shù)據(jù)堿基組成和質(zhì)量分布圖
（2）比對結(jié)果統(tǒng)計(jì)：
              比對數(shù)據(jù)Reads數(shù)分布統(tǒng)計(jì)
（3）circRNA鑒定：
              circRNA統(tǒng)計(jì)列表
              circRNA的長度分布
              circRNA的來源分布
              已知circRNA的注釋
（4）circRNA的表達(dá)水平及差異表達(dá)分析：
              circRNA的表達(dá)水平分析
              circRNA的差異表達(dá)結(jié)果
              兩兩樣本之間的差異表達(dá)
              樣本間共享和特有circRNA統(tǒng)計(jì)分析
（5）circRNA的來源基因分析：
              circRNA來源基因的GO富集分析
              circRNA來源基因的KEGG富集分析
（6）circRNA與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測分析


3、技術(shù)流程


4、案例分析
       案例（1） 外泌體circRNA可作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物
       研究人員首先分離得到了來自于MHCC-LM3肝癌細(xì)胞的外泌體并且對其進(jìn)行了circRNA-Seq。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，在細(xì)胞和外泌體中分別檢測到了5484個(gè)和6751個(gè)circRNA。研究人員將這些在外泌體中存在的circRNA命名為exo-circRNA。與細(xì)胞中的circRNA的表達(dá)水平相比，exo-circRNA在外泌體中的含量至少富集了2倍。circRNA同miRNA的結(jié)合早有報(bào)道，巧合的是miRNA在外泌體中也廣泛存在。研究人員還關(guān)注了miRNA與circRNA的結(jié)合對circRNA在外泌體中數(shù)量的影響。由于CDR1as circRNA是miR－7的海綿體，研究人員將miR-7引入細(xì)胞與外泌體中，借此觀察CDR1as的表達(dá)量。研究人員觀察到CDR1as表達(dá)量在外泌體中大幅下降，卻在細(xì)胞中略有上升。該結(jié)果表明，circRNA在外泌體中的確會(huì)受到miRNA表達(dá)量的影響和調(diào)控。
 
圖1 circRNA在外泌體中受到miRNA表達(dá)的調(diào)控


       案例（2） KRAS突變細(xì)胞分泌的外泌體中環(huán)狀RNA的表達(dá)情況
       研究者用三種同源KRAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞系建立了環(huán)狀RNA文庫，每種細(xì)胞系設(shè)有兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，且不使用RNase R處理。經(jīng)過一系列檢測和RNase R處理驗(yàn)證，最終確定在三種目標(biāo)細(xì)胞系中可以識(shí)別和量化大量的環(huán)狀RNA，且環(huán)狀RNA對RNase R處理具有抗性。接著，研究者檢測環(huán)狀RNA的表達(dá)水平是否受KRAS調(diào)控，比較了三種細(xì)胞系中候選RNA的水平。發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA在KRAS突變細(xì)胞中被下調(diào)，且環(huán)狀RNA調(diào)控在主基因中能獨(dú)立出現(xiàn)。為了檢測結(jié)腸癌細(xì)胞分泌的外泌體中能否檢測到環(huán)狀RNA，研究者還對三種細(xì)胞系的外泌體RNA進(jìn)行了RNA-seq分析，并用qRT-PCR對結(jié)果加以驗(yàn)證，每種細(xì)胞系設(shè)有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。結(jié)果表明，環(huán)狀RNA具有復(fù)雜的外泌體穿梭機(jī)制。與KRAS突變型細(xì)胞衍生的外泌體相比，野生型中RNA結(jié)合蛋白的豐度更高。
 
圖1 qPCR驗(yàn)證3個(gè)細(xì)胞系外泌體中候選circRNA和host gene的表達(dá)量


參考文獻(xiàn)
[1] Li et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Research, 2015.
[2] Dou et al. Circular RNAs are down-regulated in KRAS mutant colon cancer cells and can be transferred to exosomes. Scientific Reports, 2016.

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