外泌體（exosomes）是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種直徑約 30-120nm 的膜性囊泡。幾乎所有種類的細(xì)胞都能分泌外泌體，
并存在于人體各種體液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、腦脊髓液等。外泌體含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其
他細(xì)胞的功能，參與免疫反應(yīng)、抗原提呈、腫瘤轉(zhuǎn)移、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等生理和病理過程 。
外泌體可運載不同種類的核酸，如 DNA、mRNA 和 miRNA，rRNA，snoRNA 等，其中 miRNA 受到最多的關(guān)注，由于它在基因表達(dá)調(diào)控上有著重要作用。
miRNA 是一類 17-24nt 長的小的非編碼 RNAs，是一類重要的 sRNA（small RNA，sRNA）。miRNA 通過與 mRNA 的 3’ UTR 或者開放閱讀框 ORF 區(qū)域結(jié)合，
能介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，與細(xì)胞增殖分化、遷移、疾病發(fā)生和疾病進(jìn)展都有關(guān)系。外泌體的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，能很好的保護(hù)其包被的 miRNA，使其可作為疾病
診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[2]，影響腫瘤生長、增殖和轉(zhuǎn)移。
外泌體 smallRNA 測序可以得到不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下 sRNA 的表達(dá)情況，其中 miRNA、siRNA 以及 piRNA 是研究的熱點，也是項目分
析的重點。外泌體 smallRNA 測序可以找到不同樣本間差異表達(dá)的 miRNA，也可以鑒定新的 miRNA。通過生信分析得到其靶位點所在基因的 GO 功能注釋以及
KEGG pathway 注釋，最終可以得到外泌體 small RNA 在生物體中參與的生命活動的一個清晰的生物信息圖譜。


1、實驗方案
      測序策略：Illumina 平臺  SE50
      數(shù)據(jù)量： 10M clean reads/樣

2、技術(shù)優(yōu)勢
   通量高：一次測序得到上千萬條序列；
   分辨率高：可以檢測小RNA單個堿基的差異；
   精準(zhǔn)度高：從幾個到幾十萬個拷貝精確計數(shù)；
   可重復(fù)性好：深度測序保證了抽樣隨機(jī)性，重復(fù)性好，無需重復(fù)實驗；
   檢測范圍廣：既能鑒定已知小RNA，又能發(fā)現(xiàn)新的小RNA。

3、數(shù)據(jù)分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評估；
（2）樣品間的公共序列和特異序列分析；
（3）小RNA與參考基因組比對分析；
（4）按照優(yōu)先級將小RNA進(jìn)行分類注釋
（5）Novel Small RNA預(yù)測；
（6）樣本間miRNA差異表達(dá)分析；
（7）已知miRNA的家族分析；
（8）已知miRNA差異分析（≥2個樣本）和聚類分析（≥3個樣本）；
（9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因預(yù)測；
（10）已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注釋和KEGG通路分析；
（11）novel miRNA差異分析（≥2個樣本）和聚類分析（≥3個樣本）；
（12）差異miRNA靶基因預(yù)測；
（13）已知miRNA的堿基編輯分析；
3.2 高級信息分析
（1）snoRNA注釋
（2）piRNA注釋
（3）mir2disease注釋

4、技術(shù)流程
 

5、參考文獻(xiàn)
       案例（1）卵巢癌細(xì)胞通過基質(zhì)細(xì)胞外泌體傳遞的miR21靶向APAF1獲得紫杉醇抗性
       晚期卵巢癌細(xì)胞通常會發(fā)生大網(wǎng)膜脂肪組織處的轉(zhuǎn)移，但是網(wǎng)膜基質(zhì)細(xì)胞來源的分子對卵巢癌生長的影響還未見太多報道。本文通過二代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中miR21的表達(dá)量明顯高于卵巢癌細(xì)胞。通過功能研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)的脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的miR21可以轉(zhuǎn)移到卵巢癌細(xì)胞中，從而抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡并通過結(jié)合一個新發(fā)現(xiàn)的靶mRNA—APAF1賦予其化療抗性。這些數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞的惡性表型可通過從相鄰網(wǎng)膜基質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體遞送miR21來獲得，抑制基質(zhì)細(xì)胞來源的miR21可能是治療轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性卵巢癌的一個新策略。

圖1 腫瘤相關(guān)的脂肪細(xì)胞分泌的外泌體中miR21表達(dá)上調(diào)

圖2 卵巢腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中miR21的表達(dá)差異情況

       案例（2）外泌體miRNA可用于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷
       該研究從早期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的血漿中分離腫瘤來源的外泌體。利用miRNA-seq對46個I期NSCLC患者和42個健康個體的外泌體miRNA進(jìn)行分析，以鑒定和驗證腺癌（AC）和鱗狀細(xì)胞癌（SCC）的特異性miRNA。與健康個體相比，AC和SCC患者分別有11個和6個miRNA表達(dá)水平顯著增高，13個和8個miRNA表達(dá)水平顯著降低。不同的腺癌和鱗癌特異性的外泌體miRNA進(jìn)一步被驗證。與以前研究報道一致，miRNA-seq數(shù)據(jù)證實了可用于診斷NSCLC和其他癌癥的潛在miRNA，如let-7、miR-21、miR-24和miR-486。結(jié)果表明，miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p為AC特異性的，miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b為SCC特異性的。采用AUC值為0.899、0.936和0.911，分別檢測NSCLC、AC和SCC，評估三種組合miRNA組的診斷準(zhǔn)確度。這些miRNA在用于早期NSCLC診斷并用于高度敏感的非侵入性生物標(biāo)志物是非常有希望的。

圖1 鑒定和定量健康個體、AC患者和SCC患者腫瘤來源的外泌體

圖2 qPCR驗證miRNA表達(dá)的結(jié)果

       案例（3）外泌體攜帶的miR-25-3p和miR-92a-3p能夠刺激惡性脂肪肉瘤的發(fā)展
       盡管近年來已發(fā)展出針對脂肪肉瘤（LPS）的聯(lián)合治療方案，但大部分患者對這些療法僅有輕微應(yīng)答，并且可能導(dǎo)致局部或遠(yuǎn)端的腫瘤復(fù)發(fā)。早期檢測到腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移可以通過早期臨床干預(yù)來改善患者的預(yù)后。然而，目前還缺乏有效的生物標(biāo)志物。該研究使用患者血漿和細(xì)胞系作為研究對象，證明了miR-25-3p和miR-92a-3p是由LPS細(xì)胞通過細(xì)胞外囊泡分泌的，可用作潛在的疾病診斷生物標(biāo)志物。miR-25-3p和miR-92a-3p以TLR7 / 8依賴性方式刺激腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）分泌促炎細(xì)胞因子IL-6，這反過來促進(jìn)LPS細(xì)胞增殖，侵襲與轉(zhuǎn)移。該研究提供了新的LPS發(fā)展機(jī)制，LPS細(xì)胞與其微環(huán)境之間的通訊對LPS的發(fā)展具有重要作用。該研究揭示了循環(huán)miRNA可作為疾病診斷以及監(jiān)測治療效果的生物標(biāo)志物。

圖1 LPS患者樣本中PBV和PB的miRNA表達(dá)情況

參考文獻(xiàn)
[1] Au Yeung et al. Exosomal transfer of stroma-derived miR21 confers paclitaxel resistance in ovarian cancer cells through targeting APAF1. Nature Communications, 2016.
[2] Jin et al. Evaluation of tumor-derived exosomal miRNA as potential diagnostic biomarkers for early stage non-small-cell lung cancer using next-generation sequencing. Clinical Cancer Research, 2017.
[3] Casadei et al. Exosome-derived miR-25-3p and miR-92a-3p stimulate liposarcoma progression.Cancer Research, 2017.

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