長鏈非編碼 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類長度在200nt以上且不編碼蛋白質的RNA，以帶polyA尾和不帶polyA尾兩種形式廣泛存在于各種生物體內，參與細胞內多種過程調控，具有跨物種的低保守性，組織特異性表達和豐度低等特點。
       近年來的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記、染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾和核內運輸?shù)榷喾N重要的調控過程，但絕大部分lncRNA的功能目前仍不清楚。應用高通量測序技術，研究人員能夠快速獲得與疾病或者特定生物學過程相關的lncRNA 并進行深入研究。

1、實驗方案
     測序策略：Illumina 平臺 PE150
     數(shù)據(jù)量：12G clean data

2、技術優(yōu)勢
（1）任意物種檢測：相對傳統(tǒng)芯片而言，無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因或基因組信息，能夠直接對任何物種進行最全面的轉錄組分析；
（2）分辨率高：可以檢測轉錄本中單堿基的差異；
（3）檢測范圍廣：從幾個到數(shù)十萬個拷貝精確計數(shù)，可同時鑒定正常和稀有的轉錄本；
（4）信息分析廣：可以做基因差異表達分析、可變剪切、融合基因分析；新轉錄本預測及注釋。

3、 數(shù)據(jù)分析
3.1 標準信息分析
（1）數(shù)據(jù)過濾及質量評估
（2）核糖體RNA去除率計算
（3）比對參考基因組及統(tǒng)計
（4）基因表達水平分析
（5）基因表達差異及聚類分析
（6）差異基因KEGG生物通路富集分析（僅限于模式物種）
（7）差異基因GO功能富集分析（僅限于模式物種）
（8）已知mRNA表達量分析
（9）已知mRNA差異表達及聚類分析
（10）已知lncRNA表達量分析
（11）已知lncRNA差異表達及聚類分析
（12）預測新lncRNA
（13）新lncRNA鑒定和表達量分析
（14）新lncRNA差異表達及聚類分析
（15）新lncRNA家族分析
（16）SNP和InDel檢測與注釋
（17）生物學重復樣品間相關性分析
（18）蛋白互作網絡分析
（19）基因融合
（20）主成份分析（PCA）
（21）特征性差異表達基因分析
（22）lncRNA保守性分析
（23）可變剪切
3.2 高級分析
（1）已知mRNA-lncRNA共表達網絡構建
（2）基因結構優(yōu)化及優(yōu)化基因的表達值計算 
（3）eQTL分析

4、技術流程


5、案例分析
       案例（1）瘦豬和肥胖豬組織中l(wèi)ncRNA的表達水平不同
       該研究對豬的兩個品種陸川和杜洛克的肝臟、肌肉和脂肪組織分別進行了lncRNA測序，共鑒定出4868個lncRNA轉錄本，其中3235個為新轉錄本，而且lncRNA和mRNA的表達模式是組織特異性的。脂肪組織中差異表達的lncRNA具有794個潛在的靶基因，這些靶基因富集到脂肪細胞因子信號通路、PI3k-Akt信號通路和鈣離子信號通路。此外，差異表達的lncRNA位于13個脂肪相關的數(shù)量性狀位點，其中包括65個QTL_ID。接著，分析了同一QTL_ID中的lncRNA和mRNA，并通過qPCR證實了其在兩個QTL_ID中的共表達。該研究為兩個豬品種脂肪代謝差異的分子機理提供了新的觀點，為進一步研究lncRNA在肥胖發(fā)育中的調控作用奠定了重要基礎。

圖1 組織中l(wèi)ncRNA和mRNA的差異表達
 

圖2 lncRNA和mRNA差異表達的熱圖

       案例（2）長非編碼RNA控制造血干細胞功能
       造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有獨特的基因表達程序，能夠自我更新和分化成各類成熟血細胞。長非編碼RNA（lncRNA）已成為基因表達和細胞命運決定的重要調節(jié)因子，盡管它們在HSC中的功能尚不清楚。該研究對純化的HSC進行l(wèi)ncRNA測序，鑒定出323個未注釋的lncRNA。比較這些lncRNA在差異譜系中的表達顯示159個lncRNA富集于HSC，其中一些可能是是HSC特異性的（LncHSC）。這些lncRNA基因與編碼蛋白基因具有相似的表觀遺傳學特征，如通過DNA甲基化調節(jié)表達。敲低兩種LncHSC對HSC自我更新和譜系定型產生了的不同影響。該研究結果表明，lncRNA在HSC調控中起重要作用，為HSC調控的遺傳回路提供了一個新的思路。

圖1 HSC特異的lncRNA的鑒定

參考文獻
[1] Yu et al. Comparative analyses of long non-coding RNA in lean and obese pig. Oncotarget, 2017.
[2] Luo et al. Long non-coding RNAs control hematopoietic stem cell function. Cell Stem Cell, 2015.

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