T淋巴細胞（T cell）和B淋巴細胞（B cell）主要負責適應性免疫應答，其抗原識別主要依賴于T細胞受體（T cell receptor, TCR）和B細胞受體（B cell recptor, BCR），這兩類細胞表面分子的共同特點是其多樣性，可以識別多種多樣的抗原分子。BCR的重鏈和TCRβ鏈由V、D、J、C四個基因片段組成，BCR的輕鏈和TCRα鏈由V、J、C三個基因片段組成，這些基因片段在遺傳過程中發(fā)生重組、重排，組合成不同的形式，保證了受體多樣性。
傳統(tǒng)免疫組庫研究方式局限性較大，10xGenomics新推出的“單細胞免疫譜分析”利用其微流控芯片制備單細胞體系，選擇5'端接頭的通用引物和免疫分子恒定區(qū)的巢式引物進行V(D)J富集，實現(xiàn)在單細胞水平，對成對的重鏈和輕鏈（B細胞）或α和β鏈（T細胞）進行全長測序，為免疫組庫全面、系統(tǒng)的研究提供了高效的技術平臺，對疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制研究有重要的意義。

圖1. 10xGenomics單細胞系統(tǒng)

1 技術原理

10xGenomic單細胞免疫組庫測序是建立在GemCode技術上的微流體平臺，將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個細胞包裹在油滴中；接下來在每個油滴內(nèi)，凝膠珠溶解，細胞裂解釋放mRNA，通過逆轉錄產(chǎn)生用于測序的帶條形碼的cDNA。液體油層破壞后，cDNA一分為二，后續(xù)同時進行基因表達和免疫組庫文庫構建；其中TCR或者BCR的V(D)J序列通過設計在TCR或者BCR的C區(qū)域的巢式PCR引物進行富集。然后使用Illumina測序平臺對文庫進行測序檢測，即可一次性獲得大量單細胞的基因表達和免疫組庫數(shù)據(jù)，實現(xiàn)在單細胞水平同時對基因表達和免疫組庫進行研究。

圖2 . V(D)J重組產(chǎn)生TCR、BCR多樣性

2 樣本要求

◆ 樣品類型：新鮮人或小鼠細胞懸液、血液（全血、PBMC等）；
◆ 細胞來源：血液提取、磁珠富集、流式分選、組織解離；
◆ 細胞大?。盒∮?0um；
◆ 細胞總量：細胞懸液，一個樣本細胞起始量約1x105個。
◆ 質(zhì)量要求：細胞活性大于85%，理想濃度為1000個/ul(500~2000個/μl)。
◆ 細胞培養(yǎng)基及緩沖液不能含有Ca2+和Mg2+等影響酶活性的物質(zhì)。

3 實驗流程

利用10xGenomics平臺完成單細胞的分離、反轉錄成cDNA后，選擇不同的研究目的進行文庫構建：5’基因表達文庫、TCR的V(D)J文庫或和BCR的V(D)J文庫。將cDNA分成2份或3份同時進行TCR/BCR的V(D)J富集、文庫構建、測序和5’單細胞轉錄組文庫構建、測序，獲得每個細胞表達譜和V(D)J全長序列，獲得數(shù)據(jù)進行細胞亞群聚類、細胞表達特征和標記分子篩選等分析。

圖3.  5’單細胞表達譜和V(D)J免疫組庫實驗流程



圖4.  5’單細胞表達譜和V(D)J免疫組文庫的比較



表1.  5’單細胞表達譜和V(D)J免疫組文庫及測序參數(shù)

4 分析內(nèi)容

測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制；

比對與注釋：樣本基本信息結果統(tǒng)計，樣本contig注釋信息結果統(tǒng)計，樣本Consensus序列注釋信息結果統(tǒng)計；

Clonotype分型；

特征分析：CDR3特征分析，V/J基因特征分析，V-J Paired特征分析；

多樣本分析：樣本間Clonotype比較，Overlapping Clonotype聚類分析，Overlapping Clonotype差異分析。

5 技術優(yōu)勢

可實現(xiàn)配對的重鏈和輕鏈（B細胞）或α和β鏈（T細胞）的全長測序；

精確到單細胞水平，能獲得大量單細胞的免疫組數(shù)據(jù)；

大規(guī)模單細胞VDJ+表達譜測序，單個細胞成本大大降低；

同時獲得5’gene expression的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)，可與免疫組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析

6 案例分享

Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment
CELL影響因子: 30.41   Elham Azizi at el. 2018.

了解腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的表型，對于癌癥進展和免疫治療反應的研究至關重要。研究者使用單細胞RNA測序分析了來自8位原發(fā)性乳腺癌患者的45,000個免疫細胞，同時也添加了正常乳腺組織、血液和淋巴結中的免疫細胞作對照。研究者開發(fā)了預處理流程SEQC和貝葉斯聚類和歸一化方法Biscuit，用來解決單細胞數(shù)據(jù)固有的計算難題。研究中觀察到正常免疫細胞與腫瘤組織中免疫細胞之間有顯著相似性，但后者針對腫瘤微環(huán)境出現(xiàn)特異性連續(xù)表型擴展。對來自另外27,000個T細胞的成對單細胞RNA和T細胞受體（TCR）測序，結果揭示了TCR組合使用對表型多樣性的影響。研究結果支持T細胞連續(xù)活化模型，但不符合癌癥中的巨噬細胞極化模型。本研究結果對表征腫瘤浸潤免疫細胞具有重要意義。

華銀健康高通量測序檢測中心
中心定位于科研服務與臨床醫(yī)學轉化應用，致力于生物醫(yī)學各領域的相關研究與測序大數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，為各大高校、醫(yī)院和科研單位提供醫(yī)學科研項目的實驗設計、測序方案和數(shù)據(jù)分析為一體的一站式服務。形成以臨床應用為導向的轉化醫(yī)學中心，力爭為客戶提供專業(yè)、快速的臨床醫(yī)學檢測服務。
目前，華銀高通量檢測平臺擁有Illumina和Thermo Fisher等高通量測序儀組成的大規(guī)模高通量測序服務平臺，科研服務可提供涵蓋外泌體組學、免疫組學、基因組學、轉錄組學、微生物組學、蛋白組學和代謝組學等各種測序服務和高級生物信息分析服務；臨床檢測服務包括遺傳性腎病全譜基因檢測、臨床病原微生物檢測、腫瘤分子病理檢測等服務。

10×單細胞免疫組庫測序,10×單細胞免疫組庫測序

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注：該產(chǎn)品未在中華人民共和國食品藥品監(jiān)督管理部門申請醫(yī)療器械注冊和備案，不可用于臨床診斷或治療等相關用途