華銀健康｜開(kāi)學(xué)季，簽單送豪禮
活動(dòng)時(shí)間：9月1日-10月1日
10X 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、m6A 甲基化測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
活動(dòng)期間，達(dá)到簽單要求的客戶(hù)均可享受華銀健康高通量測(cè)序VIP價(jià)格，簽單金額高，享受的優(yōu)惠幅度越大！



傳統(tǒng)的高通量測(cè)序是對(duì)某一組織整體的細(xì)胞合集進(jìn)行測(cè)序和分析，而某一個(gè)細(xì)胞的基因信息則會(huì)被整體覆蓋。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)基因組與表型之間的關(guān)系認(rèn)識(shí)越來(lái)越深刻，單個(gè)細(xì)胞也有可能攜帶重要的信息。
10x單細(xì)胞測(cè)序是使用10x genomics平臺(tái)，將單細(xì)胞懸液中的每個(gè)細(xì)胞分別進(jìn)行標(biāo)記，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和PCR建庫(kù)測(cè)序，分析單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息。單細(xì)胞測(cè)序可以揭示復(fù)雜細(xì)胞群體的異質(zhì)性，避免單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)信號(hào)被群體的平均化所掩蓋。


1、10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)實(shí)驗(yàn)方案
     測(cè)序策略：Illumina 平臺(tái)  PE150
     數(shù)據(jù)量：數(shù)據(jù)量與捕獲的細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，捕獲細(xì)胞越多，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量也越多，具體如下：

捕獲細(xì)胞數(shù)量

平均每個(gè)細(xì)胞raw reads數(shù)

數(shù)據(jù)量

2000-5000

40~100k

60G

5000-7000

40~60k

90G

7000-10000

40~60k

120G

2、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）精準(zhǔn)分選：利用10X Genomics平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)真正的單細(xì)胞測(cè)序；
（2）細(xì)胞捕獲率高達(dá)65%，可實(shí)現(xiàn)大量大細(xì)胞的快速高效標(biāo)記、測(cè)序和分析；
（3）項(xiàng)目周期短，技術(shù)應(yīng)用范圍廣。

4  單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)信息分析
1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控和定量

1.1 測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)與質(zhì)控

1.2 數(shù)據(jù)定量

1.3 多樣本數(shù)據(jù)合并和定量均一化

1.4 最終鑒定細(xì)胞表達(dá)量矩陣

2 細(xì)胞亞群分類(lèi)
2.1細(xì)胞過(guò)濾
2.2單細(xì)胞亞群分類(lèi)
3 Marker基因分析
4 差異富集分析
4.1差異基因GO富集性分析
4.2 差異基因KEGG富集性分析
5 高級(jí)分析
5.1 已知基因在細(xì)胞亞群表達(dá)分布及熱圖
5.2 細(xì)胞分化擬時(shí)序分析
5.3 細(xì)胞相互作用圖譜
5.4 加權(quán)基因共表達(dá)（WGCNA）分析
5.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析
5.6 細(xì)胞周期鑒定


4、技術(shù)流程

5、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)案例分析
案例（1）Nature | 對(duì)可重復(fù)形成人體大腦皮層的“微型人腦”單細(xì)胞多樣性研究

通過(guò)對(duì)LN患者和健康個(gè)體的腎臟、血液和尿液樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果顯示，血液與腎臟中檢測(cè)到的細(xì)胞分子特征存在相似性和差異性，而尿液與腎臟中白細(xì)胞亞群的分子活化狀態(tài)高度相關(guān)，有望作為腎臟活檢的代替物。使用低分辨率聚類(lèi)將所取腎臟細(xì)胞分為了10個(gè)集群，基于譜系標(biāo)記基因和其他基因上調(diào)，將集群標(biāo)記為髓細(xì)胞（C4,C6）、T/NK細(xì)胞（C0,C1,C2,C5）、B細(xì)胞（C3,C8）、分裂細(xì)胞（C9）和腎上皮細(xì)胞（C7）。接下來(lái)，將每個(gè)譜系的細(xì)胞分別進(jìn)行聚類(lèi)，一共確定了21個(gè)免疫細(xì)胞集群和一個(gè)上皮細(xì)胞集群（圖2）。 

案例（2）Nature Immunology | 狼瘡性腎炎患者的腎臟免疫細(xì)胞組成單細(xì)胞測(cè)序分析
 

通過(guò)對(duì)LN患者和健康個(gè)體的腎臟、血液和尿液樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果顯示，血液與腎臟中檢測(cè)到的細(xì)胞分子特征存在相似性和差異性，而尿液與腎臟中白細(xì)胞亞群的分子活化狀態(tài)高度相關(guān)，有望作為腎臟活檢的代替物。
使用低分辨率聚類(lèi)將所取腎臟細(xì)胞分為了10個(gè)集群，基于譜系標(biāo)記基因和其他基因上調(diào)，將集群標(biāo)記為髓細(xì)胞（C4,C6）、T/NK細(xì)胞（C0,C1,C2,C5）、B細(xì)胞（C3,C8）、分裂細(xì)胞（C9）和腎上皮細(xì)胞（C7）。接下來(lái)，將每個(gè)譜系的細(xì)胞分別進(jìn)行聚類(lèi)，一共確定了21個(gè)免疫細(xì)胞集群和一個(gè)上皮細(xì)胞集群（圖2）。
研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究從LN患者和活體供體對(duì)照中獲得的腎臟樣本，揭示了LN腎臟免疫群體的復(fù)雜性，識(shí)別了髓細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等多種疾病特異性亞群。研究發(fā)現(xiàn)： 大量的分裂細(xì)胞和NK細(xì)胞,表明IFNγ和細(xì)胞溶解分子的主要來(lái)源，CD8+T細(xì)胞中衰竭標(biāo)記的少量表達(dá)表明了LN中的細(xì)胞毒性。浸潤(rùn)白細(xì)胞的干擾素反應(yīng)特征與血液中，趨化因子受體CXCR4和CX3CR1在腎臟免疫細(xì)胞中頻繁表達(dá)，提示它們可能是潛在的治療靶點(diǎn)，尿液免疫細(xì)胞基因表達(dá)與相應(yīng)的腎臟白細(xì)胞高度相關(guān)。





參考文獻(xiàn)
[1] Arazi, A., Rao, D. A., Berthier, C. C., Davidson, A., Liu, Y., … Diamond, B. (2019). The immune cell landscape in kidneys of patients with lupus nephritis. Nature Immunology.
[2] Velasco, S., Kedaigle, A. J., Simmons, S. K., Nash, A., Rocha, M., Quadrato, G., … Arlotta, P. (2019). Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature, 570(7762), 523–527.

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