16S rDNA測序是利用高通量測序技術(shù)對樣品微生物的16S rDNA擴增產(chǎn)物的片段進行測序，能夠?qū)μ囟l件下細菌種類和豐度進行有效的鑒定。16S rDNA 指細菌基因組中編碼核糖體16S rRNA分子對應(yīng)的DNA序列。16S序列由9個高變區(qū)組成，中間是保守區(qū)，是最常用的細菌分類標(biāo)準(zhǔn)。通過提取環(huán)境樣品的DNA，擴增其中16S rDNA基因，可以鑒定絕大多數(shù)細菌?；贗llumina MiSeq平臺的16S rDNA測序可以一次性完成多個樣本的平行測序，可以進行樣品中細菌多樣性、物種豐度、種群結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化等諸多信息分析。

 1、實驗方案
      測序策略：Illumina MiSeq PE300/PE250
      數(shù)據(jù)量：每個樣>5萬條clean reads

2、技術(shù)優(yōu)勢
（1）準(zhǔn)確性高：從堿基保守水平測定，真實反映物種情況；
（2）快速高效：相比于傳統(tǒng)鑒定方法，16S測序鑒定微生物更快速和準(zhǔn)確；
（3）過程簡單：環(huán)境樣品的最優(yōu)解決方案，完全擺脫繁雜的菌株分離工作；
（4）靈敏度高：可以鑒定到低豐度細菌；
（5） 降低成本：需測序數(shù)據(jù)量少，檢測成本低。

3、數(shù)據(jù)分析
（1）按標(biāo)準(zhǔn)流程進行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評估；
（2）Tags拼接、過濾；
（3）物種組成分析（與RDP、Silva、GreenGene等數(shù)據(jù)庫比對）；
（4）OTU統(tǒng)計及venn圖分析；
（5）OTU Rank曲線；
（6）物種積累曲線；
（7）物種注釋及其豐度分析（柱狀圖和熱圖分析）；
（8）物種系統(tǒng)進化分析；
（9）單個樣本復(fù)雜度分析（α多樣性分析）；
（10）樣本間/組間α多樣性差異統(tǒng)計分析及盒形圖；
（11）樣品間復(fù)雜度分析：β多樣性heatmap分析；
（12）β多樣性PCoA分析（2D/3D）；
（13）NMDS-2D/3D分析；
（14）樣本組間差異分析：Adonis分析，相似性分析，RDA/CCA分析等；
（15）不同樣本間物種組成聚類分析（樣品數(shù)≥3）
（16）其他高級分析：比如PICRUSt預(yù)測宏基因組的功能組成。

4、技術(shù)流程


5、案例分析
       案例（1）多發(fā)性硬化病與腸道微生物組的關(guān)系
       腸道微生物對于免疫系統(tǒng)的功能發(fā)揮著重要的意義，同時與多種自身免疫疾病相關(guān)。Beth Isreal Deaconess醫(yī)療中心的人員使用Miseq和454測序儀，通過對60例MS（多發(fā)性硬化疾?。┗颊吆?3例健康人進行腸道16s rRNA測序并分析，發(fā)現(xiàn)MS患者的腸道中Methanobrevibacter和Akkermansia兩種菌豐度增高，同時還伴有Butyricimonas的豐度降低。接受治療后，患者腸道中Prevotella和Sutterella的豐度有所上升，Sarcina有所降低。提示了腸道微生物的菌種改變有助于發(fā)現(xiàn)MS起病原因。

圖1 MS患者和健康人腸道微生物的差異分析
       案例（2） 紅斑狼瘡患者兼患牙周炎齦下牙垢16S rDNA測序揭示口腔微生物的多樣性
       紅斑狼瘡是免疫系統(tǒng)疾病，很多患者會同時患有口腔疾病。該研究募集了52例SLE患者（伴有牙周炎35例，無牙周炎17例）和52例非SLE對照（伴有牙周炎28例，無牙周炎24例）；共采集104份齦下牙垢，提取總DNA后，利用Illumina Miseq平臺行16S rDNA測序V4區(qū)域。SLE患者牙周炎發(fā)生地更加普遍且更嚴(yán)重，且年齡更小。SLE會影響口腔微生物的多樣性。在患有牙周炎的群體中，SLE患者較對照組口腔微生物多樣性低。微生物的相互關(guān)系分析中，非SLE對照樣本共鑒定到89個細菌關(guān)聯(lián)，而SLE患者樣本中共發(fā)現(xiàn)了111個細菌關(guān)聯(lián)。

圖1 對照組（紅色）和非牙周炎SLE樣本（綠色）具有不同相對豐度的OTU

參考文獻
[1] Jangi et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications, 2016.
[2] Corrêa et al. Subgingival microbiota dysbiosis in systemic lupus erythematosus: association with periodontal status. Microbiome, 2017.

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