免疫組庫（Immune Repertoire，IR）是指某個個體在任何特定時間點其循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B淋巴細胞和T淋巴細胞的總和。T細胞和B細胞分別介導機體的細胞免疫和體液免疫應答，分別通過其表面的T細胞受體（TCR）和 B細胞受體（BCR）來識別和結合抗原，進而發(fā)揮功能清除病原體或體內腫瘤細胞。
       免疫組庫高通量測序是通過多重PCR或SMART RACE法擴增TCR/BCR全長或CDR3區(qū)序列（主要是TCR的β鏈或BCR的重鏈），再結合高通量測序技術，對機體免疫組庫的多樣性及每種 T、B細胞克隆的獨特性序列組成和變化進行分析，從而全面評估機體的免疫狀態(tài)，明確疾病與T、B細胞克隆組成及變化之間的關系。隨著免疫組庫高通量測序技術的不斷發(fā)展和成熟，基于免疫組庫多樣性變化特點的生物標志物發(fā)現、腫瘤等疾病療效預測、疾病的易感性和抵抗性、感染性疾病及疫苗研究等方面都取得了重要進展。

1、實驗方案
     測序策略： Illumina 平臺 PE150
     數據量：1G raw date/樣

2、樣本要求
（1）分選的T或B細胞：建議細胞數103-107個，離心后保存于1ml Trizol中并混勻，低溫保存運輸。
（2）外周血單個核細胞（PBMC）：建議細胞數103~107個，離心后保存于1ml Trizol中并混勻，低溫保存運輸。
（3）新鮮全血：采集外周血于EDTA抗凝管內，混勻后取 250μl，保存于750μl Trizol LS并混勻，低溫保存運輸。
（4）組織：取50~100mg組織，保存于1ml Trizol中，低溫保存運輸。
（5） 如果客戶自提 RNA，建議最好用進口試劑或試劑盒提取，最后溶于無RNA酶的水中。如果是分離的PBMC，RNA濃度大于50ng/μL，總量大于500ng。如果用組織提 RNA，濃度＞500ng/μL，總量＞5μg。 

3、技術優(yōu)勢
（1）擁有自主發(fā)明專利的UMI標記與校正算法(發(fā)明專利號：201810618023.7)，對PCR擴增與測序過程引入的錯誤與偏倚進行有效糾正，極大提高分析結果的準確度。
（2）采用當前免疫組庫擴增最有優(yōu)勢的5' RACE法，保證結果的可靠性和后期研究的方便性；
（3）針對微量細胞樣本（>100個），可以采用微量建庫技術，大大提高建庫成功率；
（4）由武漢大學、中山大學、南方醫(yī)科大學以及美國斯坦福大學研究人員組成的專業(yè)的研究和分析團隊，保證研究結果的可信度和可重復性；
（5）運用國際認可的專業(yè)的免疫組庫分析模塊，并結合我們自己獨有的生物信息分析算法，所提供的標準化的分析流程即可滿足科研或臨床所需。另外我們還可提供數據的深度分析服務（需另收費）；


4、數據分析
（1）測序數據質量評估
（2）克隆的鑒定與計數
（3）不同V/D/J基因的計數、頻率和頻率檢驗
（4）不同V/D/J基因組合的計數、頻率和頻率檢驗
（5）有顯著差異的克隆型頻率
（6）CDR3長度分布
（7）CDR3氨基酸與核苷酸序列的克隆計數、頻率和有關分析
（8）樣本間CDR3氨基酸序列的相關性、相似性和多樣性評估
（9）樣本間共有克隆分析

5、技術流程


6、案例分析
      案例（1） 免疫組庫測序揭示肝癌組織TCR多樣性及其意義（由華銀高通量完成）
      T淋巴細胞通過特異性T細胞受體（TCR）識別抗原肽，在人類適應性免疫應答中扮演著重要角色。TCR多樣性與宿主免疫反應及腫瘤預后密切相關。盡管腫瘤浸潤性T淋巴細胞對腫瘤預后有一定的影響，但很少有研究對乙型肝炎病毒（HBV）相關肝細胞癌（HCC）中的腫瘤組織和非腫瘤組織中的TCR多樣性進行詳細地特性描述。本研究對來自48位HBV相關HCC患者的肝癌腫瘤組織進行免疫組庫測序。與癌旁組織相比，腫瘤組織CDR3氨基酸（aa）克隆型具有顯著較高的平均數（2259 vs.1324，p＜0.001），TCR多樣性顯著升高（Gini協(xié)同系數，p＜0.001；Simpson指數，p＜0.01；Shannon熵，p＜0.001）。對中央Morisita-Horn相似指數（MHSI）的分析顯示，在腫瘤組織與癌旁組織之間TCR庫相似性較弱。本研究在肝癌患者腫瘤中觀察到T淋巴細胞具有廣泛的異質性，以及在相鄰癌旁組織中有較高的HEC。腫瘤組織和癌旁組織中差異化T細胞庫顯示了乙肝相關性肝癌患者體內獨特的T細胞免疫微環(huán)境。

圖1 腫瘤及癌旁組織中Vβ和Jβ基因片段使用頻率熱圖
 

圖2 CDR3 aa克隆類型多樣性的分析

       案例（2） 大規(guī)模t細胞受體測序闡明CD8+淋巴細胞在拉斯穆森腦炎中的致病機理
       拉斯穆森腦炎（Rasmussen encephalitis, RE）是一種罕見的兒科癲癇疾病伴隨有半腦炎癥和進行性神經系統(tǒng)缺陷。為了闡明RE的免疫反應過程，德國明斯克大學神經學研究所對RE患者的22例血液，2例腦脊液，和5例腦組織切片樣本還有兒科樣本參照進行T細胞受體（TCR）測序。RE患者樣本表現為外周CD8+T細胞的擴散程度與疾病的嚴重程度相關。此外，在CNS中，RE是唯一的具有T細胞擴散的兒科癲癇疾病。同時提示在RE中，外周擴散的CD8+淋巴細胞的抗原特異性會侵害CNS，可通過限制其進入CNS來改善。

圖1 RE患者的TCR組庫嚴重受限制
 

圖2 RE患者特異性的克隆中CDR3區(qū)和Vβ基因的長度分布

圖3 中樞神經系統(tǒng)干細胞移植前后TCR組庫的情況及不同樣本間共享的克隆類型

       案例（3）個體遺傳差異導致獨特的淋巴細胞受體和抗原細胞
       適應性免疫系統(tǒng)的保護機體的能力是需要不同的淋巴細胞抗原受體完成的。然而個體差異基因和后天因素導致的差異和影響還沒有被完全闡釋。斯坦福大學醫(yī)學院通過對5對同卵雙生雙胞胎的B、CD4+ T和CD8+ T淋巴細胞進行分析，來量化遺傳因素在V(D)J重組過程和胸腺選擇中的影響。選取PBMC進行RNA提取后利用反轉錄獲得目的片段并構建免疫組文庫，使用Miseq進行2x300 bp測序，最后分析免疫組庫的差異性。

圖1 遺傳性因素影響的未成熟細胞的基因使用分析圖
 

圖2 未成熟細胞和記憶細胞的CDR3區(qū)域特征遺傳傾向性

參考文獻
[1] Chen et al. High-throughput T cell receptor sequencing reveals distinct repertoires between tumor and adjacent non-tumor tissues in HBV-associated HCC. OncoImmunology, 2016.   
[2] Schneider-Hohendorf et al. CD8+ T-cell pathogenicity in Rasmussen encephalitis elucidated by large-scale T-cell receptor sequencing. Nature Communications, 2016.                 
[3] Rubelt et al. Individual heritable differences result in unique cell lymphocyte receptor repertoires of na?ve and antigen-experienced cells. Nature Communications, 2016.

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