產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

    Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit)是用EGFP標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒?？梢允褂昧魇郊?xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
    Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報(bào)道可以調(diào)控一些PKC的活性。
    Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。
    用帶有綠色熒光的熒光探針EGFP標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-EGFP，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡(jiǎn)單而直接地檢測(cè)到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
    本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚
期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對(duì)于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-EGFP可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。
    綜上所述，用Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色后，正常的活細(xì)胞不被Annexin V-EGFP和碘化丙啶染
色；凋亡早期的細(xì)胞僅被Annexin V-EGFP染色，碘化丙啶染色呈陰性；壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可以同時(shí)被Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色。
    一個(gè)包裝的本試劑盒共可以檢測(cè)50個(gè)樣品。 
包裝清單：

保存條件：
    4℃保存，Annexin V-EGFP和碘化丙啶染色液需避光保存，半年有效。為長(zhǎng)期保存，可以把碘化丙啶染色液適當(dāng)分裝后-20℃保存，Annexin V-EGFP結(jié)合液可以直接-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
    如果有細(xì)菌或真菌污染，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)效果。
    染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
    如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會(huì)消化并降
解Annexin V-EGFP，最終導(dǎo)致染色失敗。
    熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過程中也盡量
注意避光保存。
    需自備PBS。
    本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放
于普通住宅內(nèi)。
    為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1.對(duì)于懸浮細(xì)胞：
  A.在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g(約1000-2000rpm)離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸
    細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后
    續(xù)Annexin V-EGFP的結(jié)合。
  B.取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細(xì)
   胞。
  C.加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻。
  D.加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
  E.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重
    懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
  F.隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-EGFP為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。如果用于熒光
    顯微鏡檢測(cè)，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片
    后，熒光顯微鏡下觀察。
2.對(duì)于貼壁細(xì)胞：
  A.把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(可含有
    EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰
    酶的過度消化。
  B.加入步驟2A中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)
    胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：加入步驟2A中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生
    凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì)
    消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-EGFP導(dǎo)致染色失敗。
  C.取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細(xì)
    胞。
  D.加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻。
  E.加入10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
  F.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重
    懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
  G.隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-EGFP為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。如果用于熒光
    顯微鏡檢測(cè)，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片
    后，熒光顯微鏡下觀察。
3.對(duì)于貼壁細(xì)胞的原位熒光顯微鏡檢測(cè)：
  注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測(cè)不到。
  A.(選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對(duì)多
    孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。
  B.吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。(如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。)
  C.加入195μl Annexin V-EGFP結(jié)合液。
  D.加入5μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻。
  E.加入10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
  F.室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重
    懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
  G.隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-EGFP為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。